Никулина Кристина
МОУ СШ №17, 10 класс,
г. Волжский
Новые технологии и жизнь (микробиология, биохимия)
Много лет люди жили в окружении микроорганизмов, не подозревая об их существовании и даже не представляя, что пользуются продуктами их жизнедеятельности, страдают и гибнут от болезней, вызываемых микроорганизмами. Но несмотря на это, уже в VI - V вв. до н.э. человек пользовался плодами их деятельности: виноделие, хлебопечение, сыроделие, выделка кож - процессы, проходящие с участием микроорганизмов. Тогда же, в древности, ученые и мыслители предполагали, что многие болезни вызываются какими-то посторонними невидимыми причинами, имеющими живую природу. В настоящее время благодаря появлению такой науки как микробиология мы имеем представление о мире, который лежит за пределами разрешающей способности человеческого глаза.
Микробиология (от греч. micros - малый, bios - жизнь, logos - учение) - наука, изучающая строение, жизнедеятельность и экологию микроорганизмов - мельчайших форм жизни растительного или животного происхождения, невидимых невооруженным глазом. Она изучает всех представителей микромира (бактерии, грибы, простейшие, вирусы). По своей сути микробиология является фундаментальной биологической наукой.
И поскольку я решила связать свою жизнь с биологией, мой выбор пал на тему «Микробиология, биохимия». Поэтому целью настоящего обзора является анализ возможностей, недостатков и перспектив масс-спектрометрических (МС) технологий в микробиологической диагностике.
MALDI-TOF MS (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация): качественный прорыв в микробиологической диагностике
В силу своей методологической значимости и широких методических возможностей основным методом микробиологической диагностики является микробиологический метод исследования, в реальной диагностической практике воплощающийся в виде четырёх приложений: бактериологического, микологического, паразитологического, вирусологического методов исследования. Целью каждого из перечисленных методов исследования является выделение из исследуемого биологического материала чистой культуры микроорганизма с последующей её идентификацией в соответствие с действующей классификацией микроорганизмов и с клинически детерминированной степенью точности. В повседневной бактериологической диагностической практике идентификация микроорганизмов осуществляется, главным образом, посредством комплекса фенотипических методик, в том числе, автоматизированных; методики генотипической идентификации, как правило, внедрены в практику специализированных лабораторий лишь крупных лечебных учреждений. Среди автоматизированных систем фенотипической идентификации бактерий и грибов доминируют биохимические бактериологические анализаторы, идентифицирующие культуры по их способности к ферментации широкого набора субстратов. При всех несомненных достоинствах, бактериологические анализаторы не лишены определённых недостатков.
Подобных недостатков лишена методика время пролётной матрично-активированной лазерной ионизационно-десорбционной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS), позволяющая идентифицировать микроорганизмы по спектрам высоко консервативных белков: рибосомных белков и белков “домашнего хозяйства”. Современные MALDI-TOF MS-анализаторы, оснащённые представительными базами данных, позволяют идентифицировать до 7 тысяч наименований микроорганизмов с видовой либо родовой степенью точности, превосходя по достоверности идентификации бактериологические анализаторы. MALDI-TOF MS-анализаторы являются аппаратами открытого типа: их конструкцией предусмотрена возможность создания параллельной (“домашней” – “home-made”) базы данных, пополняемой пользователем в зависимости от стоящих перед ним клинических, эпидемиологических, экологических и иных задач. Именно последнее свойство выгодно отличает MALDI-TOF MS-анализаторы от бактериологических анализаторов – аппаратов статичного типа, принципиально не предполагающего внесения каких-либо изменений в структуру диагностического исследования. Таким образом, целесообразность внедрения MALDI-TOF MS в микробиологическую диагностическую практику не оставляет сомнений. ([1])
MALDI-TOF масс-спектрометр состоит из трех функциональных частей:
1) лазер, под воздействием которого происходит десорбция/ионизация;
2) анализатор масс, который делит ионы согласно их соотношению масса/заряд (m/z) по времени
пролета в вакууме;
3) детектор — устройство для определения разделенных ионов.
Механизм ионизации:
- При облучении лазером с длительностью импульса несколько наносекунд и высокими величинами интенсивности излучения (106 — 107 Вт/см²) из образца, представляющего собой твердый раствор или смесь анализируемого вещества и матрицы, происходит выброс материала в виде микрочастиц. Такие частицы могут достигать размеров несколько сотен микрометров. Над поверхностью образца возникает область высокого локального давления — так называемый факел (от англ. англ. plume — факел, шлейф, султан), который преимущественно состоит из нейтральных частиц. Вместе с тем, в нем присутствуют и заряженные частицы, доля которых по разным оценкам составляет 10−5—10−3 от полного числа всех частиц. На начальном этапе образования факела его плотность близка к плотности вещества в конденсированном состоянии.
- C расширением факела (в первые наносекунды) происходит распад конгломератов вплоть до образования отдельных молекул или их фрагментов, а также заряженных (преимущественно матричных) частиц. Ионизацию молекул, происходящую непосредственно при выбросе материала из конденсированного состояния, принято рассматривать как первичную.
- В расширяющемся факеле происходят непрерывные соударения между частицами, в том числе возможны ион-молекулярные реакции между матричными заряженными частицами и молекулами анализируемого вещества, которые приводят к ионизации последнего. Такого рода ионизацию относят к вторичной. ([2])
Метод масс-спектрометрии широко использовался в научных исследованиях, преимущественно в области химических наук, много десятилетий, но только в 1975 г. группа авторов впервые высказала предположение, что с использованием этой технологии можно получать масс-спектрометрические характеристики бактерий. Они отметили, что бактериальные экстракты различных родов и видов обладают уникальными спектрами. Появление и развитие в конце 1980-х годов мягких ионизирующих технологий, таких как MALDI и электроспрей-ионизации (ESI), сделало возможным проведение масс-спектрометрического анализа крупных биологических молекул, в частности, белков. В 1996 г. впервые сообщили о возможности получения масс-спектрометрических «отпечатков пальцев» интактных бактериальных клеток с использованием МALDI-TOF. С этого времени начался экспоненциальный рост числа публикаций по видовой идентификации бактерий с помощью этой технологии. MALDI-TOF MS использовали также для характеристики грибов, бактерий и вирусов. Способность MALDI-TOF к быстрой идентификации микроорганизмов обуславливает возможности использования метода в различных областях науки и практики: клинической микробиологической диагностике, исследованиях окружающей среды, контроле качества фармацевтических и пищевых продуктов. Крайне важные черты метода — высокая производительность и низкий уровень затрат — делают его перспективной альтернативой стандартным лабораторным биохимическим и молекулярным идентификационным системам.
Таким образом, MALDI-TOF масс-спектрометрия представляет собой уникальный высокоэффективный, точный и вместе с тем низкозатратный метод, получивший в последние годы широкое распространение в клинической микробиологии. Простота использования позволяет применять методику в рутинных исследованиях. Появление новых приложений, позволяющих усовершенствовать диагностику инфекций и определить резистентность возбудителей к антибиотикам, делает эту методику особенно привлекательной для многопрофильных стационаров. ([3])
Бурное развитие МС-технологий и внедрение их в микробиологию влекут за собой революционные изменения в микробиологической диагностике, которые кардинально меняют принципы медицинской микробиологии. Основным достижением МС-технологий является быстрая и надежная идентификация большинства актуальных для медицины видов, которая производится не только из чистых культур, но и из мономикробного биологического материала (т. к. главные проблемы микробиологической МС были связаны с трудностями идентификации микроорганизмов в смешанных культурах (включая биологический материал) и с отсутствием стандартных критериев МС-оценки резистентности микробов).
Перспективы МС связаны с разработкой и внедрением в практику методов внутривидового определения клинически/эпидемиологически значимых штаммов и оценки их свойств, включая вирулентность (степень способности данного инфекционного агента вызывать заболевание или гибель организма) и резистентность (сопротивляемость организма к воздействию различных факторов — инфекций, ядов, загрязнений, паразитов и т. п.).
На основе вышесказанного могу предположить, что внедрение МС носит глобальный характер. Быстрый прогресс в развитии прикладных МС-технологий дает надежду на то, что многие болезни в течение ближайших лет будут побеждены и канут в лету, как это было, например, с чумой или холерой.
______________________
[1]https://cabinet-nmo.ru/maldi-tof-ms-kachestvennyy-proryv-v-mikrobiologicheskoy-diagnostike_117091244
[2] https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9C%D0%B0%D1%82%D1%80%D0%B8%D1%87%D0%BD%D0%BE-%D0%B0%D0%BA%D1%82%D0%B8%D0%B2%D0%B8%D1%80%D0%BE%D0%B2%D0%B0%D0%BD%D0%BD%D0%B0%D1%8F_%D0%BB%D0%B0%D0%B7%D0%B5%D1%80%D0%BD%D0%B0%D1%8F_%D0%B4%D0%B5%D1%81%D0%BE%D1%80%D0%B1%D1%86%D0%B8%D1%8F/%D0%B8%D0%BE%D0%BD%D0%B8%D0%B7%D0%B0%D1%86%D0%B8%D1%8F
[3] https://transmed.almazovcentre.ru/jour/article/viewFile/33/34
https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A0%D0%B5%D0%B7%D0%B8%D1%81%D1%82%D0%B5%D0%BD%D1%82%D0%BD%D0%BE%D1%81%D1%82%D1%8C_(%D0%B1%D0%B8%D0%BE%D0%BB%D0%BE%D0%B3%D0%B8%D1%8F)